在臨床實(shí)踐中，病理學(xué)檢測(cè)通常需要化學(xué)染色等多個(gè)繁雜步驟且成本昂貴，在術(shù)中病理檢測(cè)等應(yīng)用中存在極大的局限性。利用高光譜顯微成像技術(shù)，不僅可對(duì)病理組織切片進(jìn)行無(wú)損和快速成像，還可采集到病理組織切片豐富的光譜信息，在對(duì)高光譜顯微圖像進(jìn)一步數(shù)據(jù)處理后，可獲取關(guān)于病理組織切片的生理、生化信息，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的病理診斷。高光譜顯微成像技術(shù)具有圖譜合一的特點(diǎn)，避免了化學(xué)染色法對(duì)組織樣本的傷害，不影響標(biāo)本進(jìn)行其它檢測(cè)。本文主要介紹了高光譜顯微成像技術(shù)及其發(fā)展趨勢(shì)，其中著重闡述了一種新型的可編程高光譜顯微成像技術(shù)及其所實(shí)現(xiàn)的光學(xué)染色功能，隨后重點(diǎn)介紹了高光譜顯微成像技術(shù)在病理學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀。

高光譜病理檢測(cè)主要是通過(guò)組織活檢，即采用鉗取、穿刺、局部切除等方式，從患者病變處獲取病變組織進(jìn)行病理診斷的一種方法。通過(guò)固定、取材、包埋、切片、染色等一系列方法制作出病理切片，由病理醫(yī)師通過(guò)大體觀(guān)察組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)鏡下觀(guān)察，結(jié)合組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)等觀(guān)察方法，來(lái)綜合對(duì)病變做出病理診斷。病理檢查主要是為了明確病變性質(zhì)，及時(shí)做出準(zhǔn)確的病理診斷，為臨床治療、評(píng)估預(yù)后提供重要的理論依據(jù)。病理診斷比臨床上單純根據(jù)病史、癥狀和體征做出的分析性診斷，以及利用各種影像做出的診斷，更具有客觀(guān)性和準(zhǔn)確性。

在臨床病理檢測(cè)中常常需要染色來(lái)獲得病理切片，而傳統(tǒng)化學(xué)染色方法步驟繁雜且成本十分昂貴，耗時(shí)長(zhǎng)，其每一個(gè)步驟和環(huán)節(jié)都可能影響最終檢測(cè)結(jié)果。尤其在化學(xué)染色中由于固定劑類(lèi)型不合適 [2]，染色試劑不適當(dāng) 和切片機(jī)性能較差等產(chǎn)生的問(wèn)題均會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生巨大影響。另外，在實(shí)際臨床病理工作中，常遇到經(jīng)一種染色后不能確診進(jìn)而需要進(jìn)一步標(biāo)記的情況，然而染色后的樣本通常難以重復(fù)利用或需褪色后再行染色等復(fù)雜操作。高光譜顯微成像技術(shù)，利用所采集到的病理組織切片豐富的光譜信息并經(jīng)進(jìn)一步數(shù)據(jù)處理后，可獲取關(guān)于病理組織切片的生理、生化信息，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的病理診斷，可有效避免化學(xué)染色法對(duì)組織樣本的傷害。近年來(lái)隨著高光譜顯微成像技術(shù)的日趨成熟，其在病理檢測(cè)中的應(yīng)用也逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。此外，本文還進(jìn)一步闡述了一種新型的可編程高光譜顯微成像技術(shù)及其所實(shí)現(xiàn)的光學(xué)染色功能。與傳統(tǒng)化學(xué)染色方法對(duì)比，光學(xué)染色由于沒(méi)有使用染色劑進(jìn)行操作，減少了操作過(guò)程中造成的圖像誤差并保留完整標(biāo)本，而且成像速度上有大幅度提高，進(jìn)一步提高了高光譜顯微成像技術(shù)在臨床病理檢測(cè)中的應(yīng)用范圍。

高光譜顯微成像技術(shù)

高光譜顯微技術(shù)將高光譜成像和生物顯微鏡相結(jié)合，由于高光譜成像技術(shù)光譜分辨率高、光譜波段多、圖譜合一，近年來(lái)得到了廣泛的應(yīng)用。與傳統(tǒng)顯微成像相比，它可對(duì)生物組織切片同時(shí)獲取目標(biāo)的形態(tài)圖像信息和光譜信息，提供更多維度的信息進(jìn)行病理分析，輔助醫(yī)生和醫(yī)學(xué)研究者從另一個(gè)角度研究生物切片。

高光譜顯微成像系統(tǒng)主要由成像光譜儀、CCD相機(jī)和顯微鏡三部分組成。它可按照多種不同的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類(lèi)，例如工作波段有紫外、紅外、可見(jiàn)光等;測(cè)量光譜的類(lèi)型有反射光譜、熒光光譜、拉曼光譜等;光譜色散方式有棱鏡、光柵等;采集高光譜數(shù)據(jù)方式有掃描式和快照式等。本文將按照采集高光譜數(shù)據(jù)方式分別介紹掃描式、快照式高光譜顯微成像技術(shù)和一種新型的可編程高光譜顯微成像技術(shù)。

①掃描式高光譜顯微成像技術(shù)

三種成像方式特點(diǎn)擺掃式成像方式來(lái)自于遙感獲取數(shù)據(jù)的過(guò)程，當(dāng)獲取事物反射光譜數(shù)據(jù)時(shí)，需調(diào)整光路接收光譜信息，由于其內(nèi)部的小鏡片掃描的方向垂直于飛行路徑，兩個(gè)方向上的空間掃描一次只能收集單個(gè)像素，因此這種采集高光譜數(shù)據(jù)的方式也被稱(chēng)為逐點(diǎn)掃描。結(jié)合顯微成像，需要在水平方向上移動(dòng)樣本或者移動(dòng)掃描位置來(lái)變換目標(biāo)像素點(diǎn)，如圖1(a)所示，所以這種系統(tǒng)的硬件上更加復(fù)雜，在采集數(shù)據(jù)方面消耗時(shí)間較長(zhǎng)，且效率比較低，實(shí)用性比較差。

推掃式成像也被稱(chēng)為線(xiàn)性?huà)呙?，空間兩個(gè)維度信息通過(guò)自?huà)呙韬推脚_(tái)運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)，視場(chǎng)內(nèi)的光信號(hào)依次經(jīng)過(guò)物鏡、入射狹縫和準(zhǔn)直模塊、色散元件，并成像于CCD相機(jī) [4]。推掃式和擺掃式一樣都需要解決幀同步和圖像拼接的問(wèn)題?？紤]到顯微成像對(duì)外界擾動(dòng)敏感，上述兩種機(jī)械掃描都需要額外的防震設(shè)施 [5]。與擺掃式不同是推掃式光譜成像一次掃描不是以點(diǎn)為單位，而是以列為單位采集像素點(diǎn)的空間信息和光譜信息，如圖1(b)所示，所以采集的時(shí)間效率更高，圖像的光譜分辨率和空間分辨率也會(huì)因此有所提升。由于推掃式光譜儀不需要像擺掃式光譜儀一樣有外置掃擺裝置，體積較小，更加適合應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。綜合來(lái)看，無(wú)論是從成像質(zhì)量還是成像效率出發(fā)，推掃式都相對(duì)更好一些，實(shí)用性更強(qiáng)。

凝視式成像方式與傳統(tǒng)相機(jī)類(lèi)似，但一次性?xún)H獲得目標(biāo)在單個(gè)波段的空間信息，其采集的高光譜圖像的光譜分辨率通常低于其他采集掃描式獲取的圖像，常常無(wú)法實(shí)現(xiàn)高光譜分辨率的目標(biāo)成像。由于凝視式高光譜儀內(nèi)部沒(méi)有復(fù)雜的光路結(jié)構(gòu)，體積較小，而且各譜段的圖像信息并非同一時(shí)刻掃描完成，因此它不適用于探測(cè)運(yùn)動(dòng)中的事物。凝視式每采集一個(gè)波段，需要二維濾波器如LCTF將原光譜濾波成一個(gè)窄帶光譜然后投射到探測(cè)器上，如圖1(c)所示。從某種意義上說(shuō)，這種濾波方式可視為光譜維的推掃。相對(duì)于一維推掃式系統(tǒng)，凝視型濾波速度更快，避免使用復(fù)雜的機(jī)械設(shè)置。凝視式的獨(dú)特性在于掃描的是光譜維度，而成像的是空間維度，所以當(dāng)需要對(duì)掃描的光譜信息進(jìn)行后處理時(shí)，選擇凝視式更好。

②快照式高光譜成像方式

快照式高光譜成像方式無(wú)需掃描，能夠單次直接投射光譜數(shù)據(jù)到探測(cè)器上，如圖1(d)所示，一次性獲取目標(biāo)物體的圖像信息和光譜信息。其內(nèi)部不存在動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)組件，具有抗干擾、快速成像的能力，因此適用于動(dòng)態(tài)事物，可滿(mǎn)足實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的需求。一般此類(lèi)系統(tǒng)依賴(lài)高光譜在空間上的冗余性，通過(guò)犧牲空間分辨率來(lái)增加光譜分辨率。如采用DMD來(lái)對(duì)空間信息進(jìn)行調(diào)制，以復(fù)用光譜信息實(shí)現(xiàn)高光譜成像。此外，這類(lèi)系統(tǒng)還需要使用復(fù)雜的還原算法對(duì)采集到的數(shù)據(jù)重建，需要消耗較長(zhǎng)的計(jì)算時(shí)間才能獲得最終的高光譜顯微圖像。

圖1. 典型的幾種高光譜成像方式：(a) 擺掃式;(b) 推掃式;(c) 凝視型;(d) 快照型2.3. 可編程高光譜成像技術(shù)及光學(xué)染色的實(shí)現(xiàn)

可編程濾光系統(tǒng)

基于DMD的可編程濾光片由光柵、空間光調(diào)制器與會(huì)聚鏡三部分構(gòu)成?？臻g光調(diào)制器采用數(shù)字微鏡器件DMD，充分利用其對(duì)空間光的靈活快速調(diào)制能力。與傳統(tǒng)液晶空間光調(diào)制器不同的是，其作為編碼孔徑器件可以充分發(fā)揮其高通量、高信噪比和靈活編碼的特點(diǎn)。該濾光片中合光衍射光柵用于反轉(zhuǎn)分光衍射光柵的色散過(guò)程，兩塊光柵具有相同的參數(shù)。

可編程高光譜顯微成像系統(tǒng)

可編程高光譜顯微成像系統(tǒng)與可編程濾光系統(tǒng)相比，添加了照明器件、顯微鏡以及計(jì)算機(jī)，如圖2所示。

一次像面出射的光經(jīng)過(guò)物鏡后平行入射到分光衍射光柵將光譜進(jìn)行色散，色散后的光譜經(jīng)過(guò)會(huì)聚鏡聚焦到多頻帶光譜選擇器DMD平面，并形成色散光譜;DMD通過(guò)內(nèi)部的每一個(gè)小鏡片不同角度的反轉(zhuǎn)，自由控制不同波段的光路通過(guò)，增強(qiáng)某些波長(zhǎng)并抑制其他波長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)按照預(yù)先設(shè)置的光譜透過(guò)率進(jìn)行光譜編碼調(diào)制;調(diào)制后出射的色散光譜經(jīng)過(guò)會(huì)聚鏡平行入射到合光衍射光柵，經(jīng)過(guò)鏡頭成像到探測(cè)器上，獲得濾光后的圖像。

圖2. 基于DMD的二維可編程高光譜顯微成像系統(tǒng)的示意圖

針對(duì)染色方法的研究，國(guó)內(nèi)外大多機(jī)構(gòu)尚且停留在研究傳統(tǒng)化學(xué)染色方法上，只有極少數(shù)剛剛開(kāi)始對(duì)虛擬染色方法的探索。目前加州大學(xué)洛杉磯分校Ozcan研究團(tuán)隊(duì)使用深度學(xué)習(xí)方法來(lái)對(duì)無(wú)標(biāo)簽組織樣本進(jìn)行虛擬染色，但與原圖像吻合率只達(dá)到92%左右。而國(guó)內(nèi)現(xiàn)有采用深度學(xué)習(xí)對(duì)圖像進(jìn)行染色處理的方法，僅僅是停留在對(duì)圖像的像素?cái)?shù)據(jù)處理的層面，一般情況下吻合率85%，只有針對(duì)特殊挑選的數(shù)據(jù)集才能達(dá)到95%。目前這些研究還不能完全取代化學(xué)染色方法。本文介紹的可編程高光譜顯微成像系統(tǒng)，通過(guò)卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)特定的光譜透過(guò)率，并利用可編程濾光系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)該光譜透過(guò)率，通過(guò)增強(qiáng)目標(biāo)背景區(qū)分度高的波段的透過(guò)率并抑制區(qū)分度低的波段，進(jìn)而采集到等效于化學(xué)染色后樣本的顯微圖像。

對(duì)于可編程高光譜顯微成像系統(tǒng)，泛用性強(qiáng)的光譜透過(guò)率生成算法是決定最終光譜圖像中感興趣目標(biāo)分類(lèi)效果的核心因素。盡管基于DMD的可編程濾光片可以投射任意的非負(fù)光譜透過(guò)率，但只有線(xiàn)性的光譜透過(guò)率生成算法能實(shí)現(xiàn)單次采集圖像代替高光譜數(shù)據(jù)后處理的最終目標(biāo)。目前，廣泛用于光譜數(shù)據(jù)處理的主成分分析(PCA)和線(xiàn)性判別分析(LDA)方法已被證明可以直接應(yīng)用于光譜透過(guò)率的生成;此外，線(xiàn)性的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法也已應(yīng)用于此可編程濾光系統(tǒng)。

基于主成分分析(PCA)和線(xiàn)性判別分析(LDA)相結(jié)合，推導(dǎo)了可編程光學(xué)濾波片光譜透過(guò)率的算法。文章分析了閉塞皮瓣和正常皮瓣的漫反射光譜，通過(guò)非負(fù)PCA方法從漫反射光譜數(shù)據(jù)中獲得前n個(gè)非負(fù)PCs，通過(guò)LDA模型壓縮到一維得到光譜透過(guò)率，理論分類(lèi)精度達(dá)到98.04%。利用數(shù)值模擬在Salinas等數(shù)據(jù)集上對(duì)該方法進(jìn)行了評(píng)估并與PCA-LDA方法對(duì)比，分類(lèi)準(zhǔn)確率達(dá)到96.71%，高于同數(shù)據(jù)集PCA-LDA方法95.58%的準(zhǔn)確率，分類(lèi)效果如圖3所示。

圖3. CNN分類(lèi)效果3. 高光譜顯微成像技術(shù)在病理學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用

近年來(lái)高光譜顯微成像在病理學(xué)檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。由于組織細(xì)胞的病理變化常常隨著內(nèi)部成分的變化而變化，當(dāng)入射光作用于病變組織并產(chǎn)生效應(yīng)時(shí)，所探測(cè)到的光譜就會(huì)與正常組織細(xì)胞的光譜有所不同。因此可以實(shí)現(xiàn)無(wú)損、快速檢測(cè)病灶的目標(biāo)。

癌細(xì)胞識(shí)別與探測(cè)

高光譜顯微成像技術(shù)可以幫助快速識(shí)別生物組織中癌細(xì)胞同時(shí)查看癌細(xì)胞在體內(nèi)的分布情況,其依據(jù)原理是對(duì)組織切片中的正常細(xì)胞和癌細(xì)胞進(jìn)行光譜采集，得到光譜和空間數(shù)據(jù)，并依此建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)細(xì)胞種類(lèi)進(jìn)行鑒別，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞分布的可視化并且精準(zhǔn)快速檢測(cè)癌細(xì)胞。利用高光譜成像技術(shù)對(duì)前列腺癌進(jìn)行檢測(cè)，提取癌組織和正常組織的光譜特征，如圖4所示，使用最小二乘支持向量機(jī)對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)，使高光譜圖像分類(lèi)方法的靈敏性和特異性分別為92.8% ± 2.0%和96.9% ± 1.3%。Halicek [20] 等利用高光譜成像技術(shù)獲得的光譜信息對(duì)頭頸部腫瘤進(jìn)行腫瘤邊緣分類(lèi)，在鱗狀細(xì)胞癌與正?？谇唤M織中，其準(zhǔn)確性、靈敏性和特異性分別為81%、84%和77%;在甲狀腺癌中，其準(zhǔn)確性、靈敏性和特異性分別為90%、91%和88%。

皮膚疾病的檢測(cè)與診斷

2006年，Dicker等用高光譜顯微成像系統(tǒng)對(duì)用常規(guī)蘇木伊紅染色的良性和惡性皮膚組織標(biāo)本進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)正常皮膚、良性病變和惡性黑色素瘤病變的光譜特征不同，如圖5所示，同時(shí)采用波形交叉相關(guān)分析方法對(duì)不同光譜進(jìn)行分類(lèi)，正確率超過(guò)85%。使用高光譜成像系統(tǒng)研究糖尿病患者以及正常人體前臂和腳的血紅蛋白飽和度，發(fā)現(xiàn)糖尿病人皮膚的血紅蛋白飽和度與正常人相比，略有減少。將高光譜成像用于預(yù)測(cè)糖尿病足潰瘍愈合的臨床研究中，HT指數(shù)預(yù)測(cè)愈合的靈感度、特異性、陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值分別為93%、86%、93%和86%。在此基礎(chǔ)上，Yudovcky等 [24] 使用光譜范圍為450~700 nm的高光譜成像系統(tǒng)來(lái)評(píng)估糖尿病足潰瘍發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)測(cè)其愈合可能性。Seroul等 [25] 結(jié)合人體皮膚的整個(gè)可見(jiàn)光譜圖像對(duì)皮膚表皮厚度、黑色素體積分?jǐn)?shù)、血液體積分?jǐn)?shù)、血氧飽和度、膽紅素體積分?jǐn)?shù)等五個(gè)參數(shù)進(jìn)行了定量測(cè)量，并灰度標(biāo)定這些參數(shù)，觀(guān)察皮膚的各種區(qū)域。

圖4. 典型小鼠中癌癥組織(虛線(xiàn))和正常組織(實(shí)線(xiàn))的光譜特征平均值

圖5. 來(lái)自三種不同組織的(左)病變區(qū)域和(右)正常區(qū)域的光譜特征的比較體內(nèi)組織和器官疾病診斷

高光譜顯微成像廣泛地用于胃、腎以及動(dòng)脈等體內(nèi)組織和器官的疾病診斷。某團(tuán)隊(duì)采集了手術(shù)切除胃組織的高光譜圖像，比較正常組織與癌變組織的光譜，發(fā)現(xiàn)了癌變組織與正常組織的光譜特征的不同，找到癌變組織的特征光譜，并將此波段數(shù)據(jù)輸入LS-SVM進(jìn)行訓(xùn)練，最終分類(lèi)靈敏度與特異性達(dá)到了93%和91%。對(duì)高光譜圖像中胃組織切片的光譜信息進(jìn)行分析以找到正常細(xì)胞和癌細(xì)胞光譜特征的不同，進(jìn)行鑒別。應(yīng)用高光譜成像系統(tǒng)對(duì)胃組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在600~800 nm范圍內(nèi)腫瘤粘膜的平均光譜吸收率高于正常粘膜組織，利用腫瘤目標(biāo)識(shí)別算法對(duì)光譜信號(hào)進(jìn)行評(píng)價(jià)和分類(lèi)，分別獲得了78.8%、92.5%、85.6%的靈敏度、特異性和檢測(cè)準(zhǔn)確率。對(duì)胃組織進(jìn)行高光譜成像并獲取組織的光譜信息用于區(qū)分腫瘤與正常粘膜。

結(jié)語(yǔ)

本文主要闡述了高光譜顯微成像技術(shù)及其在病理學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用，此外還介紹了一種新型的可編程高光譜顯微成像技術(shù)及其所實(shí)現(xiàn)的光學(xué)染色功能。目前，受制于化學(xué)染色的局限性，難以實(shí)現(xiàn)高效的病理學(xué)檢查，利用高光譜顯微成像技術(shù)，可對(duì)病理組織切片進(jìn)行無(wú)損和快速成像，同時(shí)獲得光譜信息，在對(duì)高光譜顯微圖像進(jìn)一步數(shù)據(jù)處理后，可獲取關(guān)于病理組織切片的生理、生化信息，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的病理診斷。

隨著壓縮感知技術(shù)的發(fā)展和微機(jī)電系統(tǒng)制造能力的提升，利用DMD的光調(diào)制特性對(duì)目標(biāo)圖像進(jìn)行頻譜編碼可以提高高光譜成像系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集效率，減少計(jì)算量。然而該方法在應(yīng)用過(guò)程中也存在著不足。一方面，應(yīng)用DMD的卷積方式只能對(duì)圖像光譜信息進(jìn)行線(xiàn)性分類(lèi)且無(wú)法實(shí)現(xiàn)卷積操作中負(fù)的權(quán)重值;其次，圖像采集的速度受DMD微鏡偏轉(zhuǎn)速度的限制。因此，高光譜成像未來(lái)的研究重點(diǎn)應(yīng)是尋求在光譜數(shù)據(jù)分類(lèi)過(guò)程中更有針對(duì)性更高效的數(shù)據(jù)降維方法，來(lái)減少分類(lèi)過(guò)程中的計(jì)算量并提高算法的泛化能力和可理解性，來(lái)提高分類(lèi)效果。最后，在病理學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的光學(xué)染色中利用高光譜顯微成像技術(shù)結(jié)合CNN網(wǎng)絡(luò)以及可編程濾光片對(duì)光學(xué)信號(hào)進(jìn)行處理較少。今后應(yīng)建立更加完整的高光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)一步探索對(duì)各種生物組織的染色工作。